Вы здесь

Современное обоснование трансплантации стволовых клеток пуповинной крови

Санкт-Петербургский Государственный университет, медицинский факультет Военно-медицинская академия, г. Санкт-Петербург «Покровский банк стволовых клеток», г. Санкт-Петербург Центр восстановительной медицины, г. Москва

Стволовые клетки пуповинной крови (СК ПК) используется для лечения более чем 50 заболеваний злокачественной и доброкачественной природы. Возможность лечения таких заболеваний основана на том, что СК ПК содержит гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и гемопоэтические клетки-предшественники (ГКП), которые могут заменить систему кроветворения у реципиента с соответствующими условиями кондиционирования.

Только в течение последних 20 лет свойства СК ПК, способные спасти жизнь, были применены в клинической практике. До первой успешной трансплантации СК ПК, выполненной 6 октября 1988 года и получившей свое отраженные в огромной части постоянно пополняющихся лабораторных исследований, подтверждающих, что ПК может служить потенциальным источником трансплантируемых ГСК/ГКП. ПК в основном использовалась в качестве источника для проведения проверочных исследований – оценки определенных химических параметров крови новорожденного.

Таким образом, до первой трансплантации ПК фактически считалась побочным продуктом родов и подлежала утилизации. События, которые предшествовали первой трансплантации ПК, подробно описаны в более ранних работах. Цель же данной статьи заключается в изложении краткого обзора лабораторных исследований и современных представлений, которые послужили подмостком для первой трансплантации, а также предоставить описание результатов по повышению количества ГКП, получаемых из ПК, и ex vivo увеличению клеток в объеме.
Гемопоэз можно представить себе как систему связанных трубопроводов, началом которой являются ГСК. ГСК дают начало ГКП, которые в свою очередь внутри определенной линии дифференцировки дают начало морфологически распознаваемым клеткам-предшественникам, а те соответствующим функционально зрелым клеткам крови. Хотя многие из тех знаний, которыми мы владеем о гематопоэзе, основаны на этой концепции, возможно, что эта каскадная модель в будущем претерпит изменения. Одна из новых сфер исследования, изучение индуцированных плюрипотентных СК (iPSC), ставит вопрос – под влиянием физиологических или стрессовых условий предполагаемая на данный момент схема развития клеток из ГСК/ГКП является однонаправленным потоком.

Под влиянием определенных установленных условий, зрелые клетки дифференцировались in vitro. Не известно является ли этот процесс физиологическим и происходит ли in vivo. Многое из того, что мы знаем о биологии ГСК, основано на исследованиях, проведенных на мышах. Если мышь облучить летальной дозой радиации, внутривенная инфузия тканевого источника ГСК может спасти ей жизнь.

С помощью фенотипирования определенных антигенных маркеров и выделения необходимых клеток, для сохранения жизни мыши стало достаточным получить всего лишь одну ГСК. И эти клетки обладают функциональными характеристиками, соответствующими их определенному фенотипу. Кроме того, большинство клеток, имеющих фенотип предшественников гранулоцитов-макрофагов способны к образованию колонии, содержащей гранулоциты и/или макрофаги in vitro на полутвердой питательной среде. In vitro, колониеобразование ГКП до сих пор остается золотым стандартом для определения активных ГКП. Несмотря на то, что общие фенотипы предшественников лимфоцитов, миелоидных клеток-предшественников, и мегакариоцит-эритроидных предшественников являются полезными маркерами для первоначального определения типа ГКП, существует недостаточно доказательств, подтверждающих, что каждая клетка с соответствующим специфичным фенотипом ГКП в действительности относиться к этому типу.

Система ГСК/ГКП человека не так точно обозначена, как у мыши. Несмотря на то, что ГСК человека определяются в популяции CD34+ клеток, однако их количество очень мало. CD34+ клетки, выделенные с высокой частотой, в основном представлены ГКП, но могут содержать и другие типы клеток (например, зндотелиальные клетки). На данный момент, лучшим in vivo методом определения функциональных ГСК человека признан SRC метод. Однако он не является жестким методом.

Наиболее надежным методом определения типов ГКП человека, по-прежнему является КОЕ-тест (колониеобразующая единица). Важно понимать, что фенотипы клеток могут меняться под влиянием условий культивирования или стресса. Фенотипы, характеризующие ГСК/ГКП после того, как клетки извлекут из организма человека, могут быть не достоверными после культивирования.

Существуют также пробелы в нашем понимании биологии ГСК/ГКП. Неспособность адекватно и жестко фенотипически охарактеризовать ГСК и ГПК человека, приводит к тому, что невозможно быть уверенным в том, что геномика и протеомика этих клеток в действительности специфична для ГСК и ГКП. Тогда, какой путь изберут ГСК, производство большего количества себе подобных или дифференцировку в ГКП с помощью симметричного или ассиметричного деления, скорее всего зависит от влияния межклеточного взаимодействия и цитокинов/факторов роста на уровень определенных рецепторов на поверхности ГСК. Мы до сих пор мало знаем об этих процессах. В настоящее время широко обсуждается вопрос, является ли этот процесс случайным, детерминированным, или комбинацией этих процессов. Однако, хорошо известно, что размещение ГСК внутри различных стромальных клеток и компонентов межклеточного матрикса, которые состоят из ниши, является детерминирующим фактором. Какие точно типы клеток вовлечены в этот процесс, являются объектом дискуссий, а детальный механизм, происходящий внутри клетки, и межклеточные уровни еще не известны. Остеобласты, эндотелиальные клетки и фибробласты являются важными составляющими микроокружения, которое контролируют/регулируют функции ГСК и ГПК.

В 1980 году, когда начались исследования, посвященные определению возможного применения ПК в качестве источника трансплантируемых ГСК/ГПК, были известны следующие факты: различные типы ГКП представлены в ПК; для получения ГКП, культивирование ПК может быть проведено по протоколу культивирования костного мозга; ГПК пуповинной крови могут быть увеличены ex vivo до определенного объема. Не было известно, содержит ли ПК репопулирующие/способные к приживлению ГСК, аналогичные клеткам костного мозга, и если так, то достаточно ли этих ГСК/ГКП для клинического применения в области лечения злокачественных и доброкачественных новообразований после соответствующего режима кондиционирования реципиентов.

Анемия Фанкони – заболевание, которое было выбрано для первой трансплантации ПК. Ребенку с диагнозом анемия Фанкони была проведена трансплантация ПК от HLA-идентичного сиблинга (сестра). После того, как было проанализировано большое количество образцов ПК, в которых присутствовали CFUGM, BFU-E и CFU-GEMM с высокой пролиферативной способностью (на много большей, чем наблюдалась в КМ взрослого человека), появилась уверенность, что ПК содержит клетки, необходимые для успешной трансплантации. Поскольку было установлено, что любые попытки физически отделить клетки ПК приводят к нежелательным потерям ГКП, было предложено провести первую трансплантацию без обработки ПК.
Таким образом, был создан первый банк ПК, в котором хранились замороженные образцы ПК от HLA-идентичных сиблингов. ПК для первой и 6 последующих трансплантаций была разморожена и введена без отмывки и сепарации. Свидетельством первых успешных трансплантаций служило длительное приживление кроветворения донорских клеток, что в свою очередь подтверждало, что ПК содержит не только репопулирующие/способные к долговременному приживлению ГСК, но и то, что этих клеток достаточно, чтобы сохранить жизни пациентам (в первую очередь детям и пациентам с низким весом), показанным трансплантация ГСК.

Исследования в этой области шагнули широко вперед, с тех пор, как была проведена первая трансплантация ПК. Стали появляться исследования, сообщающие о трансплантации частично совпадающих или не совпадающих по системе HLA образцов ПК, а так же применение двух единиц ПК, что в свою очередь существенно повышает вероятность их использования для трансплантации взрослым и детям с повышенным весом. Вслед за первыми успешными клиническими случаями применения ПК, исследователи подтвердили высокую пролиферативную способность незрелых субпопуляций ГСК/ГКП и их возможности к ex vivo экспансии. Так же было установлено, что ГСК/ГКП ПК могут храниться в криохранилище более чем 15 лет (а по словам руководителей некоторых лабораторий и более 22-23 лет), сохраняя при этом высокую восстановительную активность и способность к экспансии CFU-GM, BFU-E, CFU-GEMM и SRC. С момента создания первого банка ПК в Медицинском Университете штата Индиана, более чем 400 000 единиц ПК было собрано и заморожено банками по всему миру (их насчитывается более 100).

Существует несколько путей по увеличению количества ГСК/ГКП при однократном заборе ПК. Первым из них является определение метода, с помощью которого можно было собрать больше количества клеток из ПК/плаценты и, следовательно, больше количество ГСК/ГКП. Второй путь – определение метода, с помощью которого можно увеличить ГСК ПК в условиях, соответствующих медицинскому учреждению. Третий – определить эффективный способ введения ГСК/ГКП ПК в микроокружение КМ реципиента.

Сбор большего количества клеток из одного образца ПК зависит от навыков людей, выполняющих эту процедуру. Забор ПК с последующим взятием плацентарной крови, всегда приводит к большему количеству ядерных клеток и ГКП, чем забор только ПК.

Таким образом, после сбора ПК в плаценте остается, по крайней мере, столько же ГКП, сколько было получено из ПК, что требует совершенствования сбора, выделения стволовых клеток пуповинной крови.

Полный текст статьи:
Читать полный текст статьи в формате pdf
Номер журнала: