Вы здесь

Современные банки стволовых клеток – криогенные предприятия с GMP стандартом

«КриоЦентр», Центр клеточной и генной терапии, Покровский банк стволовых клеток, «КриоЦентр Санкт-Петербург», НП Институт восстановительной медицины, ГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН

Стволовые клетки являются предшественниками всех 250 видов клеток организма человека (1). Их уникальность заключается в способности самоподдержания и дифференцировки в высокоспециализированные клетки. Так, гемопоэтические стволовые клетки являются родоначальниками всех элементов крови и большинства клеток иммунной системы (3). Подтверждена ключевая роль мезенхимных стволовых клеток в регенерации ткани сердца, печени, мозга и нервных стволов, костей, хряща и мышц (2, 3).

Развитие криогенных технологий и достижения клеточной криобиологии последних десятилетий позволяет сегодня развивать принципиально новые направления в клеточной терапии ранее неизлечимых, а порой смертельных заболеваний (1, 5). В апреле 2006 г. в Чикаго (штат Иллинойс, США) состоялся международный конгресс «БИО-2006». В работе конгресса особая роль придавалась развитию центров клеточной и генной терапии, банкам стволовых клеток (БСК), криогенным предприятиям с GMP стандартом. Во время работы конгресса было отмечено, 2006-2026 гг. пройдут под девизом развития клеточных и генных технологий, а значит очень бурно будет развиваться криогенная технология и техника, понадобиться большое количество специалистов (2).

Сегодня клиническое применение стволовых клеток на лицензионной основе ограничено гематологической и онкологической практикой. Только в гематологии насчитывается более 30 заболеваний, при которых единственным шансом больного на выживание является трансплантация стволовых клеток. Сейчас в экономически развитых странах мира самым активным образом проводятся клинические испытания по клеточной терапии почти во всех отраслях практической медицины. Россия в этом смысле не является исключением. Не вызывает сомнений, что в ближайшее время будут выработаны протоколы (стандарты) для широкого клинического применения стволовых клеток в кардиологии, гепатологии, неврологии и нейрохирургии, диабетологии и других клинических дисциплинах (2, 4, 8).

Сегодня наиболее приемлемыми источниками стволовых клеток являются костный мозг, периферическая кровь после мобилизации стволовых клеток костного мозга гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, пуповинная кровь, жировая ткань.

Костный мозг – традиционный источник стволовых клеток более 30 лет используется гематологами для терапии больных злокачественными заболеваниями системы крови (3, 6). За эти годы накоплен колоссальный практический опыт выделения, хранения и клинического применения гемопоэтических и стромальных стволовых клеток. На основании этого опыта сформированы международные протоколы (стандарты) использования стволовых клеток костного мозга в терапии заболеваний (1,7)].

В силу ряда причин, отдельным уникальным источником стволовых клеток является кровь пуповины и плаценты. Во-первых, стволовые клетки пуповинной крови обладают самым высоким биологическим и, соответственно, - клиническим потенциалом. Во-вторых, эти клетки в силу своей «молодости» и «иммунной наивности» менее иммуноагрессивны. Это делает круг лиц, которым может быть успешно проведена трансплантация, более широким, нежели в случае с костным мозгом. На сегодняшний день количество хранимых образцов пуповинной крови составляет более 400 000 единиц. На основании этого материала проведено более 5000 трансплантаций гематологическим больным, 90% из них были успешны. Это очень хороший результат, за которым стоят спасенные человеческие жизни взрослых и детей. В последнее время звучит мнение о рассмотрении пуповинной крови как альтернативы костному мозгу, однако эти два источника стволовых клеток не заменяют, а дополняют друг друга (6).

Успехи исследований в сфере клеточной терапии потребовали решения технологических проблем получения, сохранения жизнеспособности и функциональной активности стволовых клеток. Развитие криогенных технологий в 80-90-е годы позволило начать создание специализированных биотехнологических предприятий – банк стволовых клеток (БСК), решающих перечисленные задачи на высокотехнологичном уровне (4).

Центры клеточной и генной терапии и БСК построены с учетом стандартов чистых помещений (2, 6, 7). Эпоха, когда эти технологии развивались на уровне научной лаборатории института или университета закончилась. Создание БСК в экономически развитых странах мира ведется последние 15 лет (6), сейчас это крупные предприятия с криогенными хранилищами соответствующие стандартам GMP и GTP.

Современный БСК с GMP стандартом решает следующие задачи: получение постнатального биологического материала, содержащего стволовые клетки; выделение и характеристика стволовых клеток; культивирование стволовых клеток; подготовка и длительное криогенное хранение образцов стволовых клеток; выдача образцов для клинического применения.

Работа этих медицинских учреждений становится обычной, а ее актуальность и целесообразность понятна обществу. Существует два типа БСК с GMP стандартом, работающих на различных принципах. Первый тип – «банки-регистры», их работа финансируется государством, продуктом их деятельности распоряжается государство в рамках национальных регистров стволовых клеток. Второй тип БСК с GMP стандартом – «именные банки». В этом случае все расходы по заготовке и хранению стволовых клеток конкретного человека (в том числе и новорожденного) оплачивает семья, она же и распоряжается данным образцом. Технологически работа обоих типов БСК с GMP стандартом выглядит абсолютно аналогичной.

В России практика БСК с GMP стандартом насчитывает более 4 лет, их деятельность подчинена приказу МЗ РФ № 325 от 25 июля 2003 года «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации», который регламентирует ключевые этапы работы по заготовке пуповинной крови, выделению из нее стволовых клеток и их длительному хранению. Рассмотрим работу этих учреждений на примере ведущего в нашей стране БСК с GMP стандартом «КриоЦентр» (Москва) с филиалом на территории Северо-Западного региона РФ в г. Санкт - Петербург. Этот пример не случаен - банк соответствует лучшим БСК Европы.

На первом этапе выполняется получение постнатального материала (пуповинной крови) и ее транспортировка в лаборатории БСК. Получение пуповинной крови не является технически сложной процедурой и не несет никакой опасности для жизни и здоровья матери и ребенка. Специалисты БСК или обученный медицинский персонал производят забор крови в максимально возможном количестве с минимальной возможностью инфицирования материала. При получении пуповинной крови в Санкт-Петербурге или любом другом городе Северо-Западного региона образец в термоконтейнере курьерской службой доставляется в лаборатории БСК с GMP стандартом «КриоЦентр» в течение 12-24 часов без предварительного замораживания.

На втором этапе идет выделение и характеристика стволовых клеток. Все манипуляции с постнатальным материалом и стволовыми клетками проводятся в «чистых» помещениях, соответствующих правилам GMP и GTP. Воздух в лаборатории подвергается особой очистке и кондиционированию. Так, в зоне непосредственных манипуляций с клетками (зона А) количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1м3 воздуха не превышает 2-3. Давление в лабораториях избыточно, что создает ламинарные потоки воздуха в наружном направлении и исключает приток извне. Из цельной крови методом сепарирования выделяют стволовые клетки, концентрируют их и помещают в аутологичную плазму с добавлением криопротектора. Выделение концентрата стволовых клеток из цельной крови является ключевым моментом. Замораживание, хранение и размораживание стволовых клеток происходит при отсутствии «баластных» клеток цельной крови. Весь полученный материал в равных объемах размещают в пробирках, которые маркируют и запаивают в защитные пеналы. С основными пробирками размещают пробирки-спутники для контроля за хранением образца или дополнительных исследований. Параллельно проводится подсчет общего числа стволовых клеток, фенотипирование, оценка их жизнеспособности и инфицированности.

Во время третьего этапа идет подготовка к длительному криогенному хранению образцов стволовых клеток – предварительное замораживание концентрата стволовых клеток. С помощью программного замораживателя с выполнением протокола температурного режима образец замораживается до –70˚С, что позволяет максимально сохранить жизнеспособность клеток. Далее образец помещается в контейнер с жидким азотом карантинного хранилища.

После получения негативных результатов бактериологических и вирусологических исследований образец из карантинного хранилища переводится в основное для постоянного хранения.

Вся технология заготовки крови, выделения, исследования и хранения стволовых клеток в БСК с GMP стандартом «КриоЦентр» контролируется компьютерной программой «Freezerwork» для исключения ошибки с участием человеческого фактора. Основное хранилище представляет помещение-сейф, стены которого выдерживают пожар в течение 5 часов. Лаборатории и хранилища обеспечены автономными источниками электроснабжения, круглосуточной физической и электронной охраной.

БСК с GMP стандартом «КриоЦентр» обеспечивает высокое качество услуг по заготовке и хранению стволовых клеток пуповинной крови организационного и технологического характера: работа сотрудников банка и четкий контроль на всех этапах планирования, заготовки, транспортировки пуповинной крови, выделения и хранения стволовых клеток; поэтапная ответственность от начала и до конца технологического процесса организации заготовки и транспортировки материала, выделения и хранения стволовых клеток; наличие собственных лабораторий и хранилищ, соответствующих стандартам «GMP» и «GTP»; современные сертифицированные клеточные технологии; страхование образца во время транспортировки и хранения.

Развитие БСК с GMP стандартом в России крайне актуально на фоне высокой встречаемости онкологических и гематологических заболеваний в нашей стране и отсутствия регистров костного мозга и пуповинной крови. БСК с GMP стандартом «КриоЦентр» может служить показательным образцом банка пуповинной крови. Практический опыт этого учреждения уже сейчас учитывается в развитии технологической базы для новых клеточных технологий в клинической практике в России.

Так, в Санкт-Петербурге реализуется проект строительства Центра клеточной и генной терапии, «КриоЦентр Санкт-Петербург», Покровский банк стволовых клеток. Проектные работы выполнены компанией «НПК ИНВАР». Весь производственный цикл будет располагаться в чистых помещениях с GMP стандартом. Это будет одно из первых предприятий в России, которое соответствует ГОСТ Р 52249-2004 (Правила GMP) и ГОСТ Р 52539-2006. Проект выполнялся на протяжении 2-х лет с привлечением консультантов из Германии, США, Японии.

Огромную роль играет подготовка высококвалифицированных кадров для управления криогенным процессом в центрах клеточной и генной терапии, БСК. Поэтому большое значение имеет подготовка специалистов на факультете криогенной техники и кондиционирования Санкт-Петербургского государственного университета холодильной техники и пищевых технологий. Специалисты данного профиля являются готовыми сотрудниками для криогенного производства БСК с GMP стандартом (2, 4).

Развитие БСК с GMP стандартом в нашей стране в последние годы обнадеживает, а строительство новых современных учреждений дает надежду больным с различной патологией. Работа банков стволовых клеток должна подчиняться жестким стандартам и правилам международного образца, что немыслимо без современных надежных криогенных технологий. Позитивное движение в этой сфере в России должно послужить толчком для отечественной промышленности в развитии криогенных технологий и криотехники.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Смолянинов А.Б., Жаров Е.В., Козлов К.Л. Кириллов Д.А. Основы клеточной и генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний. М., 2005. – 192 с.
  2. Смолянинов А.Б. Современные биотехнологические центры клеточных и генных технологий и банки стволовых клеток // Технология чистоты. - № 1, 2006. – С.4-5.
  3. Gluckman E., Broxmeyer H.A., Auerbach A.D. et al. Hematopoietic reconstitution in patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling // N. Engl. J. Med. – 1989/ - Vol.321. – P.1174-1178.
  4. Oh W., Cairo M.S., Desposito F. et al. Cord blood banking for potential future transplantation: subject review // Pediatrics. – 1999. - Vol.104, № 1. – P.116-118.
  5. Stamm C., Westphal B., Kleine H.D. et al. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration // Lancet. – 2003. – Vol.361, № 9351. – P.45-46.
  6. Steinbrook R. The cord-blood-bank controversies // N. Engl. J. Med. – 2004. – Vol.351, № 22. – P.2255-2257.
  7. Sugarman J., Kaalund V., Kodish E. et al. Ethical issues in umbrical cord blood banking // JAMA. – 1997. – Vol.278. – P.938-943.
  8. Yoon P.D., Kao R.L., Magovern G.J. Myocardial regeneration: transplanting satellite cells into damaged myocardium // Tex Heart Inst. J. – 1995. – Vol. 22. – P.119-125.
Номер журнала: